艾德華的部落格

質體純化步驟：

1. Incubate 50μl DH5α(with target gene) + 5ml LB medium(Km) @37℃ 150 r.p.m. 12hrs (or 14-16 hrs).
2. Centrifuge 1 ml Broth @ 13000r.p.m. 2min, then remove the supernatant.
3. Add 200 μl FAPD1 and disperse the pellet by pipetting.
4. Add 200 μl FAPD2 and rotate the eppendorf 10 times gently , then stand it for 2 min (until solution become transparent but don’t over 5 min).
5. Add 300 μl FAPD3 and rotate the eppendorf 10 times gently after that  centrifuge it @13000r.p.m. 8min.
6. Transfer the supernatant to a new eppendorf ,then centrifuge it @13000r.p.m. 8min.
7. Transfer the supernatant to a new combined column ,then centrifuge it @13000r.p.m. 30sec after that discard the liquid in the bottom.
8. Add 400 μl W1 buffer then centrifuge it @13000 r.p.m., 30 sec after that discard the liquid in the bottum.
9. Repeat step 8.
10. Add 600 μl Wash buffer then centrifuge it @13000 r.p.m., 30 sec after that discard the liquid in the bottum.
11. Centrifuge it again @ 13000 r.p.m., 3 min, then combine the upper column with a 1.5 ml eppendorf.
12. Stand it at 37℃ in the incubator for 10 min.
13. Add 50 μl hot water and stand for 2 min after that centrifuge it @13000 r.p.m. 2 min.
14. Collect the liquid in the bottom and add to the upper column again, then centrifuge it @13000 r.p.m. 2 min.
15. Finally, analyze the concentration、O.D.₂₆₀ O.D.₂₃₀ O.D.₂₈₀ by nanodrop。

注意事項:

1. DH5a是一種能夠接受外來DNA的菌株。一般的大腸桿菌都會有類似免疫系統的機制，會產生限制酶剪切外來的DNA。DH5a不會產生限制酶剪切外來DNA，才能用來保存plasmid。若使用BL21(DE3)抽取可能會抽不出來。

2. FAPD1含Tris-HCl(pH8.0)主要功能是為了使菌均勻懸浮。我們在FAPD1加的RNAse若壞掉可能造成RNA汙染(260值過高)(因為RNAse就是用來切RNA的啦~~)

3. FAPD2主要含有SDS跟NaOH。SDS是介面活性劑主要用來破菌。NaOH是強鹼可以打斷染色體雙股螺旋DNA的氫鍵。Plasmid是以supercoiled form的型式存在不會在強鹼中denature。步驟四加入後需溫和的轉動enppendorf，轉動的過程中避免產生氣泡及劇烈搖晃，否則容易DNA斷裂，之後應靜置約2-5min直到溶液顏色趨於透明。(不要超過5分鐘!!!)

4. 加入FAPD3(酸性)酸鹼中和，使質體DNA和染色體DNA之ATCG的氫鍵接回，但染色體DNA太大容易接錯而沉澱，順便把其他蛋白質、RNA一起拉下來。(白色雲狀)

5. 組合式column含有一個membrane使plasmid不會穿過去可以用來分離純化。吸取上清液含質體DNA至組合式eppendorf並離心將DNA及離子鹽類濾到membrane上。

6. 加入W1含70%酒精，將鹽類離子洗掉。沖洗兩次避免鹽類汙染。

7. 加入wash含100%酒精，使DNA容易乾燥。

8. 放入37℃培養箱，為使酒精揮發乾淨，若酒精揮發不完全，容易造成酒精汙染(230太高)，但不宜放置太久，若太乾燥可能造成DNA黏在membrane上不易沖提下來。

9. 以加熱過(約60℃)的蒸餾滅菌水沖提兩次，怕DNA都黏在membrane上而濃度過低測不準。

10. 步驟2若離心太多菌液(例如2ml)，可能導致菌量太多，RNAse作用不夠，造成RNA汙染。或者在加完FAPD3後沉澱物太多，不易分離到組合式離心管。

11. 目前榮總可用的抽plasmid kit放置在筑婷學姊的抽屜下的櫃子裡，鎧全學長抽屜下那套抽出來的260/280都會偏高，推測是PS1 (FAPD1)內的RNAse作用不好。

12. 260/280太高可能原因： RNA汙染(260太高)。若RNA汙染則可能是FAPD1內的RNAse壞掉，或者加入的菌量太多導致RNAse作用不完全。

13. 260/280太低可能原因：蛋白質汙染，可以重複加完FAPD3後的離心步驟，離完一次之後取上清液到另一乾淨的enppendorf再離心。

14. 260/230太低可能原因：鹽類汙染(230太高)、酒精汙染(230太高)，若鹽類汙染，則可以多重複w1及wash的步驟(但要小心重複w1及wash造成酒精汙染)，若酒精汙染則可以在wash後增加離心時間，或是增加烘乾的時間(但要小心避免烘太久造成plasmid黏在membrane上)。

15. 260吸收值太低原因：菌量不夠，或者plasmid黏在membrane上沒有沖下來。可以嘗試增加菌量，若是plasmid黏在membrane上，可以重複沖提步驟或是水溶解的時間，並且避免在烘箱內烘太久導致太乾。

16. 正常的260/280: 1.7-1.9 (純的DNA為1.8)、260/230: 2.0-2.4。

17. 260/230太低可能造成大腸桿菌活化後平衡時期的OD值偏低，260/280太高可能造成養菌過程的生長速率變慢。反映在最後蛋白質生產的結構不穩定以及產量下降。

以上是本人花了好幾個禮拜瘋狂抽質體~抽到天荒地老沒有明天的嘔心瀝血經驗談

希望有志之士可以不要再浪費時間了!!!!!!!!!!!!!!!!!!